對于傳統的光學顯微鏡，光的衍射讓成像分辨率限制在大約250 nm。如今，超分辨率技術可以將此提高10倍以上。這種技術主要通過三種方法實現：單分子定位顯微鏡，包括光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）；結構照明顯微鏡（SIM）；以及受激發射損耗顯微鏡（STED）。 如何選擇超分辨率技術，這是大家都關心的?！安恍业氖?，并沒有簡單的原則來決定使用哪種方法，”英國牛津大學的博士后研究員Mathew Stracy說。 “每一種都有其自身的優點和缺點?！? 科學家當然也在想辦法，為特定的項目選擇合適的方法。以色列理工學院的助理教授Yoav Shechtman表示：“在生物成像的背景下，要考慮的關鍵因素包括：空間和時間分辨率、對光損傷的敏感性、標記能力、樣本厚度，以及背景熒光或細胞自體熒光?！?工作原理 各種超分辨率顯微鏡是以不同的方式工作的。以PALM和STORM為例，在特定時刻，只有一小部分熒光標記激發或光活化，使得它們能夠高精度地獨立定位。讓所有熒光標記都經歷這個過程，這也就帶來了一幅完整的超分辨率圖像。2014年諾貝爾化學獎的獲得者之一、馬普生物物理化學研究所主任Stefan Hell表示：“PALM/STORM系統相對容易搭建，但比較難以應用，因為熒光基團必須具有光活化能力。局限之處在于它們需要檢測細胞背景下的單個熒光分子，在可靠性上不及STED?！? STED使用激光脈沖來激發熒光基團，并使用環形的激光來淬滅熒光基團，只留下中間納米大小的熒光而得到超高分辨率。掃描整個樣本，可生成一幅圖像?！癝TED的優勢在于它是一種按鈕技術，”Hell解釋說?！八闷饋砭拖駱藴实墓簿劢篃晒怙@微鏡?！彼€可以利用一些熒光基團對活細胞進行成像，比如綠色或黃色的熒光蛋白和羅丹明衍生染料。 參數對比 盡管所有超分辨率技術在分辨率上都超越了傳統的光學顯微鏡，但彼此也各不相同。SIM大約將分辨率提高一倍，達到100 nm左右。PALM和STORM則可以分辨15 nm的目標。據Hell介紹，STED在活細胞中可提供30 nm的空間分辨率，在固定細胞中可達15 nm。 在涉及到特定應用時，我們還必須考慮信噪比。在有些情況下，分辨率較低但信噪比較高可能會比相反情況（分辨率較高但信噪比較低）帶來更好的圖像。 圖像獲取的速度也相當重要，特別是對于活細胞?！八械某直媛始夹g都比常規的熒光成像技術要慢，”Stracy說?！癙ALM/STORM是*慢的，需要成千上萬幀來獲得單幅圖像，SIM需要幾十幀，而STED是一種掃描技術，所以采集速度取決于視野的大小?！? 除了活細胞或固定細胞成像，一些科學家也想了解對象如何移動。Stracy就很有興趣了解活細胞中生物系統的動力學，而不僅僅是靜態圖像。他將PALM與單顆粒追蹤相結合，來分析活細胞中的動力學。通過這種方式，他可以在標記分子行使功能時直接追蹤它們。不過，他認為SIM并不適合研究這些分子水平的動態過程，但是由于獲取速度快，它特別適合觀察較大結構的動力學，如整條染色體。 *新成果 2017年，Hell的團隊在《Science》上報道了MINFLUX超分辨率顯微鏡。據Hell介紹，這種超分辨率方法**次達到1 nm的空間分辨率。此外，它還能追蹤活細胞中的單個分子，速度比其他方法至少快100倍。 其他科學家也高度評價了MINFLUX顯微鏡。Shechtman說：“新的應用和方法在不斷開發，但是有兩個進步讓我印象深刻?！币粋€就是MINFLUX?！八捎昧艘环N巧妙的方法，來獲得非常**的分子定位?！? 關于第二個讓人興奮的進展，Shechtman提到了W.E. Moerner及其斯坦福大學的同事，Moerner也是2014年諾貝爾化學獎的獲獎者之一。為了解決熒光單分子的各向異性散射對成像分辨率的限制，這些科學家利用不同的激發極化來測定分子的方向以及位置。另外，他們還開發了精巧的光瞳面。這些技術改善了結構定位的能力。 關于熒光標記 在許多超分辨率應用中，標記真的很重要。目前也有一些公司提供相關產品。例如，德國美天旎和Stefan Hell創辦的公司Abberior合作，為超分辨率顯微鏡染料提供定制抗體結合服務。 其他的一些公司也提供與之相匹配的標記。ChromoTek的營銷人員Christoph Eckert表示：“我們的Nano-Booster非常小，只有1.5 kDa，而且高度特異?！边@些蛋白質可與綠色和紅色熒光蛋白（GFP和RFP）相結合。它們來源于羊駝抗體片段，被稱為VHH或納米抗體，具有出色的結合性能，并且質量穩定，沒有批間差。這些標記適合各種超分辨率技術，包括SIM、PALM、STORM和STED。 馬里蘭大學醫學院的助理教授Ai-Hui Tang及其同事利用ChromoTek的GFP-Booster以及STORM，來探索神經系統中的信息傳播。他們在突觸前和突觸后神經元中發現了分子納米簇，將其稱之為納米柱（nanocolumn）?？茖W家認為，這種結構表明中樞神經系統采用簡單的原理來維持和調節突觸效率。 各種版本的超分辨率成像以及越來越多的方法正帶領科學家更深入地領略生物學奧秘。在打破了可見光的衍射極限后，生物學家甚至可以“嚴密監視”細胞的行動。