相差顯微鏡是一種將光線通過透明標本細節時所產生的光程差（即相位差）轉化為光強差的特種顯微鏡。

光線通過比較透明的標本時， 光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化。因此，用普通光學顯微鏡觀察未經染色的標本（如活的細胞）時，其形態和內部結構往往難以分辨。然而，由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發生改變（產生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置——環狀光闌和相板，利用光的干涉現象，將光的相位差轉變為人眼可以察覺的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增強，使我們能比較清楚的觀察到普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內的某些細微結構。

相差顯微鏡的成像原理： 鏡檢時光源只能通過環狀光闌的透明環，經聚光器后聚成光束，這束光線通過被檢物體時，因各部分的光程不同，光線發生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環所成的像恰好落在物鏡后焦點平面和相板上的共軛面重合。因此，未發生偏斜的直射光便通過共軛面，而發生偏斜的衍射光則經補償面通過。由于相板上的共軛面和補償面的性質不同，它們分別將通過這兩部分的光線產生一定的相位差和強度的減弱，兩組光線再經后透鏡的會聚，又復在同一光路上行進，而使直射光和衍射光產生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時，通過無色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。